酸奶最初是由北方的游牧民族在保存鮮奶的過(guò)程中，鮮奶經(jīng)過(guò)自然發(fā)酵而得來(lái)，隨后慢慢發(fā)展至今。酸奶因含有豐富的益生菌和蛋白質(zhì)，口感細(xì)膩且易于消化，為廣大消費(fèi)者所喜愛(ài)。此外酸奶具有促進(jìn)腸蠕動(dòng)和胃液分泌，降低膽固醇、緩解乳糖不耐、促進(jìn)鈣的吸收等作用。
乳鐵蛋白是一種由約690個(gè)氨基酸組成的鐵結(jié)合糖蛋白，分子質(zhì)量約為80 k Da，自然條件下顏色為淡紅色。其不但可以促進(jìn)機(jī)體對(duì)于鐵的吸收與利用，從而改善貧血，還可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)鐵的方式來(lái)抑制多種病毒、真菌的生長(zhǎng)繁殖。此外乳鐵蛋白還有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗菌、抗腫瘤、促進(jìn)骨骼的生長(zhǎng)等多重生物學(xué)功能。另有研究表明，乳鐵蛋白可作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，預(yù)防以及輔助治療新型冠狀病毒。乳鐵蛋白原被收錄在GB2760中，后又被列入GB14880，認(rèn)定為食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，在嬰幼兒奶粉中，為了使奶粉的營(yíng)養(yǎng)成分更加接近于母乳、更好滿足嬰幼兒需求，奶粉生產(chǎn)廠家會(huì)使用乳鐵蛋白來(lái)強(qiáng)化奶粉中的營(yíng)養(yǎng)成分（添加量≤1.0 g/kg)，這是目前乳鐵蛋白應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域。相比之下，乳鐵蛋白酸奶的品類及相關(guān)研究較為有限，研究?jī)?nèi)容也有待進(jìn)一步深化。
乳鐵蛋白本身具有熱不穩(wěn)定性等特性，酸奶加工工藝對(duì)其影響尚不明確。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)國(guó)標(biāo)規(guī)定乳鐵蛋白作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑的范圍及用量，及其自身特性，通過(guò)改變酸奶制備工藝條件和乳鐵蛋白添加量及添加方式，探究乳鐵蛋白對(duì)酸奶品質(zhì)特性的影響，并對(duì)成品乳鐵蛋白酸奶進(jìn)行儲(chǔ)藏期實(shí)驗(yàn)，確定其貨架期，為乳鐵蛋白在酸奶中的應(yīng)用提供一定的技術(shù)依據(jù)。
全脂乳粉；白砂糖；果膠；發(fā)酵劑；天然牛乳鐵蛋白Hilmar1000；乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒。
電子分析天平；電熱恒溫水浴鍋；離心機(jī)；電子天平：高壓均質(zhì)機(jī)；數(shù)顯黏度計(jì)；p H計(jì)；多功能酶標(biāo)儀；渦旋混合器；穩(wěn)定性分析儀。
全脂乳粉、白砂糖→復(fù)原乳→加入果膠混合→預(yù)熱（55℃）→均質(zhì)（20 MPa）→85℃殺菌10min→冷卻至42℃→接種→發(fā)酵→4℃冷卻后熟24 h→破乳
在8%白砂糖，接種時(shí)加入0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%YF-L 904發(fā)酵劑的條件下，分別于30℃12 h、42℃6 h下進(jìn)行發(fā)酵，探究發(fā)酵條件對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響。
在8%白砂糖，接種時(shí)加入0.03%乳鐵蛋白，42℃6 h下進(jìn)行發(fā)酵的條件下，分別加入0.004%YF-L 904發(fā)酵劑以及YO-MIX 863發(fā)酵劑，探究發(fā)酵劑種類對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響。
在接種時(shí)加入0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%發(fā)酵劑，42℃6 h下進(jìn)行發(fā)酵的條件下，分別添加6%、8%、10%白砂糖，探究糖添加量對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響。
在8%白砂糖，使用0.004% 904發(fā)酵劑，42℃6 h下進(jìn)行發(fā)酵的條件下，在接種時(shí)分別添加0%、0.03%、0.05%乳鐵蛋白，探究乳鐵蛋白添加量對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響。
在8%白砂糖，0.03%乳鐵蛋白，使用0.004%發(fā)酵劑，42℃6 h下進(jìn)行發(fā)酵的條件下，分別在殺菌前、接種時(shí)、發(fā)酵后加入0.03%乳鐵蛋白，探究不同加工階段添加乳鐵蛋白對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響。
將待測(cè)酸奶攪拌均勻，室溫下使用p H計(jì)進(jìn)行測(cè)定。
將破乳后的酸奶置于室溫下，采用旋轉(zhuǎn)黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定時(shí)使用3號(hào)轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速設(shè)置為12 r/min。
取3 g破乳后的酸奶置于5 m L離心管中，在4200 r/min下離心15 min，棄去上清液，稱取其剩余質(zhì)量。持水力計(jì)算公式：
式中：WHC，持水力，%；G1，去除上清液后樣品與離心管總質(zhì)量，g;G2，離心前樣品與離心管總質(zhì)量，g;G，離心管質(zhì)量，g。
將20 m L破乳后的酸奶置于Turbiscan Lab專用圓柱形樣品瓶中，設(shè)定測(cè)試參數(shù)，測(cè)試溫度為25℃，每隔30 min掃描一次。4.5 h后得到樣品Turbiscan穩(wěn)定性圖譜的BS曲線。應(yīng)用Turbi Soft軟件分析計(jì)算得到Turbiscan穩(wěn)定性指數(shù)（TSI），通過(guò)TSI評(píng)估樣品的穩(wěn)定性。TSI計(jì)算公式：
式中：xi，在某以高度單次測(cè)量所獲得的樣品背散射光強(qiáng)值，%；xBS，樣品自上而下掃描后所測(cè)得的xi的平均值，%；n，掃描總次數(shù)。
使用乳鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定。
感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)RHB104-2020《發(fā)酵乳感官評(píng)價(jià)細(xì)則》進(jìn)行制定，邀請(qǐng)10位食品專業(yè)人員對(duì)酸奶的色澤、組織狀態(tài)、風(fēng)味、口感進(jìn)行評(píng)分，通過(guò)數(shù)據(jù)的處理以及分析，得出最終結(jié)果。評(píng)分采用百分制，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。
試驗(yàn)采用Excel 2016和SPSS 24.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。采用Origin 2018進(jìn)行作圖。
發(fā)酵條件對(duì)于酸奶中乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖有一定影響。由表2可知，30℃12 h組的p H偏高，尚未發(fā)酵完全，口感較稀薄。其原因是發(fā)酵溫度過(guò)低、發(fā)酵時(shí)間不足導(dǎo)致乳酸菌未能充分繁殖。42℃6 h組有更好的黏度以及持水力，此時(shí)酸奶發(fā)酵風(fēng)味濃郁，組織均勻細(xì)膩。這是由于在該發(fā)酵條件下乳酸菌發(fā)酵良好，酪蛋白膠束整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，酸奶因此產(chǎn)生更黏稠質(zhì)地，提高了酸奶的黏度與持水力。發(fā)酵條件對(duì)于酸奶中乳鐵蛋白的含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。
表2 發(fā)酵條件對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響
Table 2 Effects of fermentation conditions on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標(biāo)不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
TSI用以表征樣品的穩(wěn)定性。同一時(shí)間下，TSI的值越小、變化趨勢(shì)越平緩，樣品的分散程度越好，整體穩(wěn)定性越好。由圖1可知，隨著時(shí)間的增加，二者TSI值均在上漲，表明其穩(wěn)定性正在降低。整體結(jié)果基本相似，因此發(fā)酵條件對(duì)乳鐵蛋白酸奶的穩(wěn)定性并無(wú)影響。綜合考慮，最終確定發(fā)酵條件為：42℃6 h。
兩種發(fā)酵劑均由嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌組成。由表3可知，p H偏高，為4.55。組有更好的黏度以及持水力。發(fā)酵劑在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸較慢，因此p H較高，略有粉澀感、發(fā)酵風(fēng)味不足。發(fā)酵劑產(chǎn)酸較快，同時(shí)產(chǎn)生了更多的可以結(jié)合游離水的胞外多糖，酪蛋白網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，使得酸奶黏度、持水力更高。由發(fā)酵劑發(fā)酵所得酸奶組織均勻，無(wú)乳清析出、糊口感。發(fā)酵劑種類對(duì)于酸奶中乳鐵蛋白的含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。
圖1 發(fā)酵條件對(duì)乳鐵蛋白酸奶穩(wěn)定性的影響
Figure 1 Effects of fermentation conditions on stability of lactoferrin yogurt
表3 發(fā)酵劑種類對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響
Table 3 Effects of starter on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標(biāo)不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖2可知，YF-L 904組的TSI值比YO-MIX 863組低，因此YF-L 904組更加穩(wěn)定。其原因是乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的胞外多糖，加強(qiáng)了酸奶中蛋白的凝膠結(jié)構(gòu)，提高了乳鐵蛋白酸奶的穩(wěn)定性。綜合考慮，最終確定發(fā)酵劑種類為：YF-L 904。
糖在酸奶中承擔(dān)著賦予酸奶甜味、為發(fā)酵菌種提供碳源、增加固形物含量等多重角色。由表4可知，黏度隨糖添加量的增加而增加。p H和持水力的變化趨勢(shì)相同，均呈先增加后下降趨勢(shì)，在8%時(shí)達(dá)到最高，分別為4.36和66.33%，此時(shí)酸奶酸甜適中，口感細(xì)膩爽滑。其原因是酸奶中糖含量較低時(shí)，無(wú)法為菌種提供足夠碳源，不能滿足發(fā)酵需求，糖含量的提高促進(jìn)了菌種發(fā)酵，有利于酸奶形成較好的質(zhì)構(gòu)。糖含量偏高時(shí)，乳酸菌繁殖過(guò)度，產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致酸奶p H下降，進(jìn)而抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，最終對(duì)持水力造成了一定程度的影響。糖添加量對(duì)于酸奶中乳鐵蛋白的含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。
Table 4 Effects of sugar content on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標(biāo)不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖3可知，8%組的TSI值最低，因此最為穩(wěn)定。原因是糖含量的增加提高了酸奶中的固形物含量，對(duì)于增加酸奶黏度以及緩解脫水收縮現(xiàn)象有一定幫助。糖含量過(guò)低時(shí)無(wú)法滿足乳酸菌發(fā)酵，隨著糖含量的升高，蛋白質(zhì)凝膠結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定。糖含量過(guò)高時(shí)，乳酸菌大量產(chǎn)酸，破壞了蛋白質(zhì)的膠凝結(jié)構(gòu)，不利于提高酸奶穩(wěn)定性。綜合考慮，最終確定糖添加量為：8%。
乳鐵蛋白的含量決定了乳鐵蛋白酸奶的飲用價(jià)值。由表5可知，0.03%組p H以及黏度最高，分別為4.38和6135 m Pa·s。乳鐵蛋白的添加量與酸奶的持水力呈負(fù)相關(guān)，其原因是在低p H條件下，乳鐵蛋白的疏水基團(tuán)逐漸暴露，使酸奶持水力下降。乳鐵蛋白添加量的增加，導(dǎo)致暴露疏水基團(tuán)的增多，對(duì)持水力有顯著影響（P<0.05），同時(shí)還會(huì)使酸奶出現(xiàn)粉澀感。乳鐵蛋白添加量與酸奶中乳鐵蛋白的含量成正相關(guān)。但相比于0.03%組，0.05%組乳鐵蛋白損失率更高。另外值得注意的是，未添加乳鐵蛋白的酸奶中僅含有微量乳鐵蛋白。
表5 乳鐵蛋白添加量對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響
Table 5 Effects of lactoferrin content on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標(biāo)不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖4可知，乳鐵蛋白的添加可以提高酸奶的穩(wěn)定性。隨著時(shí)間的增加，不同乳鐵蛋白添加量的酸奶穩(wěn)定性均呈下降趨勢(shì)，當(dāng)添加量為0.03%時(shí)，穩(wěn)定性最好。添加量為0.05%時(shí)，穩(wěn)定性呈波動(dòng)趨勢(shì)且變化幅度較大，體系較不穩(wěn)定，這可能是由于乳鐵蛋白通過(guò)靜電相互作用與酪蛋白凝膠表面結(jié)合，這一作用使得酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)松動(dòng)并發(fā)生膨脹，破壞了酸奶穩(wěn)定性。而在膨脹的過(guò)程中，部分乳鐵蛋白滲透到酪蛋白膠束內(nèi)部，增加與膠束的結(jié)合水平，酸奶穩(wěn)定性因此有所提升。綜合考慮，最終確定乳鐵蛋白添加量為0.03%。
乳鐵蛋白的熱不穩(wěn)定性對(duì)其活性以及生物學(xué)功能有著重要的影響作用。由表6可知，三組的p H、黏度、持水力無(wú)顯著差異（P>0.05）。接種時(shí)添加乳鐵蛋白可使酸奶口感更為細(xì)膩，發(fā)酵香氣更為濃郁。殺菌前添加乳鐵蛋白，由于高溫殺菌過(guò)程使得乳鐵蛋白變性，導(dǎo)致乳鐵蛋白含量大幅降低。接種時(shí)以及發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，對(duì)其含量影響不顯著（P>0.05）。由此可見(jiàn)，菌種發(fā)酵過(guò)程對(duì)于乳鐵蛋白的活性并無(wú)顯著影響，這與Palmano等的試驗(yàn)結(jié)果相似。對(duì)牛奶進(jìn)行熱加工時(shí)，乳鐵蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)在55℃左右發(fā)生變化。隨著溫度的進(jìn)一步升高，乳鐵蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生膨脹，蛋白質(zhì)分子趨于無(wú)序化。溫度越高，β-轉(zhuǎn)角以及無(wú)規(guī)則卷曲越多，蛋白質(zhì)的無(wú)序化程度越高，這種變化往往不可逆。因此殺菌冷卻后添加乳鐵蛋白，可以保護(hù)其活力，降低乳鐵蛋白的損失。
圖4 乳鐵蛋白添加量對(duì)乳鐵蛋白酸奶穩(wěn)定性的影響
Figure 4 Effects of lactoferrin amount on stability of lactoferrin yogurt
表6 乳鐵蛋白添加階段對(duì)乳鐵蛋白酸奶品質(zhì)的影響
Table 6 Effect of lactoferrin adding time on the quality of lactoferrin yogurt
注：同列角標(biāo)不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）。
由圖5可知，殺菌前、接種時(shí)組的TSI值基本一致，但發(fā)酵后組TSI值較高。由此可見(jiàn)，相比于發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，在殺菌前、接種時(shí)添加，可以使乳鐵蛋白酸奶獲得更好的穩(wěn)定性。雖然接種時(shí)以及發(fā)酵后添加乳鐵蛋白，對(duì)于乳鐵蛋白的含量沒(méi)有顯著影響，但發(fā)酵后加入乳鐵蛋白的過(guò)程可能會(huì)對(duì)酸奶的凝膠結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定程度的破壞。綜合考慮，最終確定在接種時(shí)添加乳鐵蛋白。
圖5 乳鐵蛋白添加階段對(duì)乳鐵蛋白酸奶穩(wěn)定性的影響
Figure 5 Effects of lactoferrin adding time on stability of lactoferrin yogurt
酸奶在儲(chǔ)存期的品質(zhì)變化，決定了產(chǎn)品的貨架期。作為衡量酸奶優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)，儲(chǔ)存期的品質(zhì)變化一定程度上也影響了消費(fèi)者的購(gòu)買欲望。p H會(huì)影響酸奶的口感以及滋味，乳鐵蛋白含量直接決定乳鐵蛋白酸奶的飲用價(jià)值。如圖6所示，乳鐵蛋白酸奶在儲(chǔ)存期的p H整體呈下降趨勢(shì)，從4.34下降到了最終的4.10。其中0～7 d大幅下降，這是由于保加利亞乳桿菌利用酸奶中剩余乳糖繼續(xù)產(chǎn)酸，使得酸奶發(fā)生一定程度后酸化。7～14 d乳酸菌利用乳糖持續(xù)產(chǎn)生乳酸，但由于酸奶中大部分營(yíng)養(yǎng)成分已被消耗，導(dǎo)致酸奶p H的下降速率放緩。0～14 d隨著p H的下降，乳鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，α-螺旋以及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增多，乳鐵蛋白含量呈緩慢下降趨勢(shì)。14～28 d中p H無(wú)明顯變化，僅在4.08～4.10之間小范圍波動(dòng)，此時(shí)乳酸菌發(fā)酵可能已達(dá)到閾值。但乳鐵蛋白含量發(fā)生大幅減少，這可能是由于乳鐵蛋白受到微生物繁殖或其代謝產(chǎn)物的干擾和抑制，導(dǎo)致其含量減少。
圖6 乳鐵蛋白酸奶儲(chǔ)存期間p H、乳鐵蛋白含量的變化
Figure 6 Changes of p H and lactoferrin content in lactoferrin yogurt during storage period
黏度與持水力一定程度決定了酸奶的組織狀態(tài)。由圖7可知，在儲(chǔ)存期中乳鐵蛋白酸奶黏度與持水力的變化趨勢(shì)大致相同，而引起二者變化的原因也較為相似。0～7 d黏度與持水力上升，這是由于酸奶中的乳酸菌不斷生長(zhǎng)繁殖，促進(jìn)了酪蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。酸奶加工階段中被分離的凝乳微粒重新回到凝乳網(wǎng)絡(luò)體系之中，這一過(guò)程中更多的蛋白質(zhì)發(fā)生接觸，提高了蛋白質(zhì)的凝膠強(qiáng)度。后酸化過(guò)程中由保加利亞乳桿菌產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)黏度的提升也有一定促進(jìn)作用。7～14 d隨著酸奶p H的不斷下降，膠體磷酸鈣溶解，酪蛋白膠束之間的靜電作用遭到破壞，進(jìn)一步導(dǎo)致酪蛋白膠束內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，黏度、持水力因此下降。14～28 d酸奶的p H變化趨于平緩，乳酸菌發(fā)酵達(dá)到閾值，此時(shí)黏度、持水力仍舊有較大波動(dòng)，這可能是由于微生物繁殖、代謝產(chǎn)生各種物質(zhì)，導(dǎo)致酸奶品質(zhì)發(fā)生波動(dòng)。
Figure 7 Changes of viscosity and water holding capacity in lactoferrin yogurt during storage period
本試驗(yàn)確定了乳鐵蛋白酸奶的生產(chǎn)工藝及配方，試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)糖添加量為8%，使用0.004%YF-L 904發(fā)酵劑，在接種時(shí)添加0.03%乳鐵蛋白，于42℃下發(fā)酵6 h所得乳鐵蛋白酸奶口感細(xì)膩爽滑、酸甜適中，品質(zhì)最佳。對(duì)最優(yōu)配方及生產(chǎn)工藝生產(chǎn)得到的乳鐵蛋白酸奶進(jìn)行儲(chǔ)存期品質(zhì)變化觀察，發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白酸奶在0～14 d可以保持良好的品質(zhì)，14～28 d酸奶各項(xiàng)指標(biāo)變化明顯，品質(zhì)發(fā)生劣化。因此建議將乳鐵蛋白酸奶的貨架期設(shè)置為14 d。在酸奶中添加生物學(xué)功能眾多的乳鐵蛋白，可以賦予酸奶更高的飲用價(jià)值，滿足消費(fèi)者對(duì)于功能性酸奶的需求，擁有較好的市場(chǎng)前景。
